Java程序辅导

Clonal Sequencing for Genetics and 
Cancer in a Research and Diagnostic 
Setting
Graham Taylor
Leeds
People
Leeds University
• Joanne Morgan
• David Parry
• Claire Logan
• David Bonthron
• Colin Johnson
• Eamonn Sheriden
• Chris Inglehearn
• Ian Carr
• Alex Markham
Leeds NHS
• Nick Camm
• Helen Lindsay
• Antigone Tzika
• Josie Hayes
• Christopher Watson
• Lampros Mavrogiannis
• Ruth Charlton
• Paul Roberts
• Leeds Health Stars
Why bother…
On résiste à l'invasion des armées; on ne résiste 
pas à l'invasion des idées.
Victor Hugo, Histoire d'un Crime (1852)
There is one thing stronger than all the armies in 
the world, and that is an idea whose time has 
come.
Sequencing in 2007
The scale of activity
The rate of change
courtesy Stephanie Cohen & Steve Brenner 
Hype Cycle
Cost‐effective
Genetic tests
$1,000 genome
Projects
Leeds University
• Gene dosage
• Targetted re‐sequencing
• ChIP‐seq
• Transcriptome
• Tumour resequencing
Leeds NHS
• Re‐sequencing Long PCR 
products
• Gene dosage
• Targetted reseqencing
• Tumour resequencing
The Pathway to Terabase sequencing
• Generation 1: 
– Sanger/Capillary Format/Nanomolar scale
– 96 reads per run
• Generation 2
– Clonal/array format 454, Illumina, SOLiD
• Generation 2.1
– Higher cluster density Clonal/Array Format/Zeptomolar scale
– 1 billion reads per run
• Generation 2.1b
– Mini versions of 2.1
• Generation 3:
– Single molecule
Generation 2.1 sequencers: 
1012 base sequence capacity
• Reagent cost approx £3,000
• Avge genome coverage >250
• Avge exome coverage   >20,000
– £300 (reagent) exome at 2,000‐fold coverage
• aCGH will not compete
– Reduction of CNV‐seq costs by at least 10‐fold
– Ability to identify translocations
– Ability to report SNPs (uniparental disomy,autozygosity)
• Further reduction in cost of single/few gene analyses 
will not have much impact as major costs are now 
outside of the sequencing workflow
2.1b (mini‐sequencers)
• 109‐10 base capacity
• Roche Junior  (14 Gbase/£3,000)
• Illumina MiSeq (1.5 Gbase/£500)
• Ion torrent (1 Gbase/?)
• Mid range sequencers would replace most 
conventional sequencing applications but not 
achieve the economies of scale of the large 
scale sequencers e.g. exomes. CNV‐seq, 
mapping re‐arrangements
Approx cost per base Q1 2012
Whole Genome
CNV‐seq
Resolution comparable to that 
obtained from array‐CGH 
platforms (240Kb for ICSA 
8x60Kb, 225Kb for NGRL 
4x44Kb19) can be achieved 
using 2 million reads per 
sample. With increased reads, 
resolution to the level of the 
base pair is feasible with NGS
Read pairs will map 
translocations to the exact 
position
Multiplex NGS for pre‐ and post‐natal genetic diagnosis of copy 
number variation in phenotypically‐abnormal constitutional 
cases  Antigoni Tzika, Kelly Cohen, Paul Roberts
0.5Mb 
BlueGnome
BAC array 
Aneuploidy  detection
CNV‐seq
5X multiplex 10X multiplex 80X multiplex
Multiplexing and effect on resolution
• Increasing multiplexing decreases resolution
• Basic patterns visible and higher throughput and lower cost
Next Generation Sequencing (NGS) and 
Genetic Diagnostics
• NGS diagnostics is an inevitable trend because:
– Staffing and reagent costs are reduced
– Data output is increased and automated
• There will gradually be a transition in diagnostics from 
testing one or two genes to several, many and possibly 
all genes
• Since February 2010 the Leeds Genetics service has 
delivered BRCA1 & BRCA2 sequence using CPA‐
accredited NGS based on the Illumina GAIIx
– Improved reporting times
– Reduced costs
– Reduced Retest rate
The case for gene‐centric analysis
(or, “We have run out of money, we shall have to think”‐ Rutherford)
Coverage
• 1 flow cell (GAIIx) = 7 channels
• 1 channel = 40 million reads
• 1 read = 36 – 300 bases
• 1 channel = 1 – 12 Gigabases
• 1 flow cell = 24 haploid genome equivalents
• At mean coverage of 100, one channel can cover 120 Megabases (NB exome is approx 
50Mbases)
Reagent Costs
• 1 genome (x24) $10,000 (1‐plex)
• 1 exome (x50) $1,000 (1‐plex)
• 1 cardiome (1Mbase) $ 100 (10‐plex)*
• 1 gene (e.g BRCA1) $15 (96‐plex)*
*Library preparation weighting not fully costed
GGTGGC
Standard 
adaptor 
sequence
Library insert
Barcode 
sequence
Sequencing primer
Multiplexing for cost efficiency
Sample tagging – 6 base barcodes (potentially 1024 variations)
BRCA1 & BRCA2 analysis
• 671 variants (326 BRCA1, 345 BRCA2)
• 77 variants identified previously were all detected
• All pathogenic variants were detected
NGS in the Leeds Genetics lab
• Familial breast/ovarian cancer
– NGS replaced existing Sanger service for BRCA1 and 
BRCA2 for all diagnostic referrals in February 2010
– First UK NGS diagnostic reports issued in March 2010
• Hereditary non-polyposis colorectal cancer
– NGS replaced existing Sanger service for MLH1, MSH2 
and MSH6 for all diagnostic referrals in October 2010
• Hypertrophic cardiomyopathy
– MYBPC3, MYH7, TNNI3, TNNT2
• Pheochromocytoma & paraganglioma
– PRKAR1A, RET, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, TMEM127, VHL
• Marfan syndrome
– FBN1
New services introduced May 2011
Results / benefits
• Multi‐gene testing
• Reduced lab costs
• Increased capacity
• Increased reliability
• Improvement in turnaround 
times 
• Improvements in patient care 
pathways
• Close working relationship 
with research groups
Average BRCA reporting times
0
10
20
30
40
50
60
No
v-0
9
De
c-0
9
Ja
n-1
0
Fe
b-1
0
Ma
r-1
0
Ap
r-1
0
Ma
y-1
0
Ju
n-1
0
Ju
l-1
0
Au
g-1
0
Se
p-1
0
Oc
t-1
0
No
v-1
0
De
c-1
0
Ja
n-1
1
Fe
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1
R
e
p
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(
w
o
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k
i
n
g
 
d
a
y
s
)
The deliverable, the desirable and the 
fundable
• $1K genomes/exomes
• Targetted resequencing
– Incremental revision of existing services
– Stratified medicine
• Germline
• Somatic
• Syndrome‐omes
– Cardiome
– Retinome
– Ciliome
– “Cancer chip”
• Screening
– Prenatal
– Carrier
• Autozygous
• General recessive
What does this mean for clinical 
diagnostics?
The currency of genetic analysis will become DNA 
sequence
– Sequence count
– Sequence variation
– Sequence arrangement
– The currency is dropping to commodity prices
– Skill set required is less lab, more informatics biased
– genes < pathways < “omes” < genomes
Genome Informatics
• Use the co‐ordinates of the reference genome
• Use the reference sequence
• Use the annotations to the reference 
sequence
• Overlay experimental data
• Filter and output results
• Use scripts, e.g. Perl, Java, Python
• Use web applications, e.g. Galaxy 
Handling the data locally
Python driven Web front end for Genome 
Informatics
Now getting up to speed with NGS tools
Array capture
Switches from over 20 PCRs to get two 
genes to one PCR to enrich over 24 genes 
(pathway or syndrome‐driven testing)
Phenome
• Cardiome
• Ciliome
• Retinome
• Kinome
• …
Samples need to multiplex to be cost‐effective, but multiplexing
reduces capture efficiency
Autozygome
Bradford has a population of 470,000, with 
6,000 live births in 2006. Although only 18% of 
the Bradford population is of south Asian 
origin, 50% of births are to south Asian 
families 
Autosomal recessive (AR) diseases occur when 
a child inherits two copies of a gene, one from 
each parent, both genes carrying a harmful 
mutation. The chance of having a child with an 
AR condition is increased if both parents are 
blood relatives. 
In communities in which consanguineous 
marriage is common, there is a significant 
increase in the prevalence of AR disease . A 
1993 study from Birmingham recorded a 16‐
fold increase in AR diseases in the offspring of 
consanguineous Pakistani couples, compared 
to non‐consanguineous couples .
Exome
• One exome 22,000 
variants
• Filtering results
• Unknown success rate
• Exome sequencing is now 
within reach of Regional 
Genetics Services
• Recent experience in 
Leeds: 3 exomes, 3 
pathogenic variants
PCR‐ome
Preliminary(!) data on accuracy
<50 bases 1/700, proportional to 
read length >50 bases, less accurate than  
1/700, proportional to read 
length and square of read length
Detection and quantification of rare mutations with 
massively parallel sequencing
Isaac Kinde, Jian Wu, Nick 
Papadopoulos, Kenneth W. Kinzler, and 
Bert Vogelstein
NGS Genotypes
• Generated using custom Perl 
script converts FASTA or FASTQ 
files to xls genotype report
• Good signal:noise (noise <1%)
• Direct reporting of genotypes
• Forward and reverse reads 
support QC
• Unmatched reads available for 
further processing
Scale up: 
From 5 amplicons, 10 cases to 
350 amplicons, 10 cases
de novo variants
kras codon 12 6 base insertion kras codon 11 C>T
Custom Perl script groups and counts unmatched 
reads which are then used in BLASTn queries 
against reference genome build
How do I transfer cheap sequencing into 
high value diagnostics?
• Demand/Targets
– Phenotype driven
– Public Health driven
– Clinical demand driven
– Clinical utility driven
• Commissioners
• Providers
– State funded or commercial?
– Staff Training and accreditation needs 
Consequences
• Any large scale re‐sequencing effort will find 
many variants of unknown clinical significance
• These need to be recorded and to be 
searchable
• In this way, over time, we will learn more 
about their frequency and clinical significance
• But only if we have the database!
• Support your local/national/international 
mutation database
Thanks to
Academic
• Joanne Morgan
• David Parry
• Claire Logan
• David Bonthron
• Colin Johnson
• Eamonn Sheriden
• Chris Inglehearn
• Ian Carr
• Alex Markham
Service
• Nick Camm
• Helen Lindsay
• Antigone Tzika
• Josie Hayes
• Christopher Watson
• Lampros Mavrogiannis
• Ruth Charlton
• Paul Roberts
• Leeds Health Stars